Разработка способа обнаружения и идентификации ДНК токсигенных штаммов Clostridium botulinum типов А, В, Е методом ПЦР в реальном времени

  • Д. С. Янов
  • А. В. Кузнецовский
  • М. Ю. Дубровин
  • А. В. Миронин
  • Н. В. Онучина
  • А. В. Филиппов
Ключевые слова: Clostridium botulinum, биотерроризм, ботулизм, ботулинический токсин, ген bont, гибридизационно-флуоресцентная детекция, нуклеопротеиновый комплекс, пороговый цикл, ПЦР в реальном времени

Аннотация

Бактерия Clostridium botulinum вызывает у человека опасную токсикоинфекцию – ботулизм. Летальность при ботулизме в случаях несвоевременного обращения за медицинской помощью достигает 70% от количества заболевших. В основе патогенеза ботулизма лежит поражение центральной нервной системы токсином, продуцируемым C. botulinum. В настоящее время известно 7 антигенных типов такого токсина. Ботулотоксин входит в группу биологических агентов, наиболее вероятных в качестве средств биотерроризма. Так как ботулинический нейротоксин представляет собой сложный нуклеопротеиновый комплекс и следы ДНК могут быть обнаружены даже в очищенных препаратах токсина, мы разработали способ обнаружения и идентификации токсигенных штаммов Clostridium botulinum типов А, В, Е, наиболее часто вызывающих ботулизм у человека, основанный на выявлении остаточных количеств этой ДНК в ботулиническом токсине с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Основным препятствием для разработки способа обнаружения и идентификации ДНК токсигенных штаммов стала высокая вариабельность генов, ответственных за синтез ботулотоксина. Нами установлен участок гена, обладающий наименьшей гомологией у всех штаммов. Этому требованию отвечал фрагмент гена bont, кодирующий легкую цепь нейротоксина и обладающий высокой консервативностью в пределах штаммов C. botulinum, продуцирующих один тип токсина. Представлены результаты по определению аналитической чувствительности и специфической активности разработанного способа. Специфичность определения составила 100%, аналитическая чувствительность метода – 1×102 м.к./мл. Способ может быть использован для анализа продуктов питания, образцов клинических материалов и проб из окружающей среды, подозрительных на контаминацию токсигенными штаммами C. botulinum.

Опубликован
2018-12-25
Раздел
Биологическая безопасность и защита от биологических угроз