Получение рекомбинантного белка сибиреязвенного бактериолизина PlyPH и исследование in vitro его литических свойств в отношении микробных клеток Bacillus anthracis

Аннотация

Возбудитель сибирской язвы – Bacillus anthracis, вследствие распространенности его природных очагов на территории России, высокой вирулентности для человека и большинства млекопитающих, уникальной устойчивости споровых форм к воздействию факторов окружающей среды и неоднократного применения в террористических актах, представляет собой крайне опасный биологический агент. Поэтому необходим поиск новых эффективных препаратов для диагностики и лечения сибирской язвы, в том числе и заболеваний, вызванных антибиотико-устойчивыми штаммами B. anthracis. Новым направлением в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний является использование литических ферментов видоспецифических бактериофагов. Цель работы – клонирование гена сибиреязвенного бактериолизина PlyPH в составе вектора pTrcHis2C в Escherichia coli и исследование in vitro литических свойств кодируемого им белка в отношении микробных клеток B. anthracis. По данным полного секвенирования геномов B. anthracis штаммов Ames, Stern 34F2 и JB17 был выявлен в составе их хромосомной ДНК профаг, утративший часть структурных генов, необходимых для его репликации, но сохранивший ген, имеющий высокую степенью гомологии с геном бактериолизина γ фага. Для амплификации и последующего клонирования гена PlyPH нами были разработаны праймеры, содержащие сайты узнавания рестриктаз EcoRI и BamHI. Амплификацию гена PlyPH в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с разработанной парой праймеров проводили, используя в качестве матрицы ДНК штамма Stern 34F2 сибиреязвенного микроба. На основе полученных продуктов амплификации и вектора pTrcHis2C нами сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая ген PlyPH синтеза бактериолизина и стабильно функционирующая в клетках рекомбинантного штамма E. coli. В ходе исследований установлено, что микробные клетки рекомбинантного штамма TOP10 E. coli обеспечивают продукцию бактериолизина сибиреязвенного профага − PlyPH, обладающего способностью in vitro лизировать вегетативные клетки вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1.